Kenalan dengan HPLC Yuk!, Sang Pahlawan Pemisahan Senyawa

 

    

        High Performance Liquid Chromatography (HPLC) atau Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) merupakan instrumen analisis modern yang mampu melakukan pemisahan, identifikasi, kuantifikasi, bahkan pemurnian senyawa secara presisi. Menariknya, perjalanan teknik ini bermula lebih dari satu abad yang lalu. Pada tahun 1903, ilmuwan asal Rusia, Mikhail Tswett, berhasil memisahkan pigmen hijau dari daun menggunakan kolom berisi kapur (CaSO₄). Dari percobaan sederhana ini, lahirlah istilah chromatography yang terinspirasi dari jejak warna yang bergerak sepanjang kolom (Anggraini & Desmaniar, 2020). 

        Seiring berjalannya waktu, kebutuhan industri khususnya bidang farmasi dan kimia menuntut teknik pemisahan yang lebih cepat, sensitif, dan efisien. Kromatografi cair klasik yang hanya mengandalkan gravitasi terbukti lambat dan kurang akurat untuk menganalisis campuran kompleks. Inovasi pun dilakukan: kolom dengan ukuran partikel lebih kecil, detektor ber kepekaan tinggi, dan pompa bertekanan besar yang mampu mendorong fase gerak dengan stabil. Dari sinilah lahir metode HPLC, pengembangan terkini dari kromatografi cair klasik yang hingga kini menjadi standar emas dalam analisis kimia modern (Rosydiati, 2019).

         Teknik ini digunakan secara luas, mulai dari laboratorium penelitian bahan alam hingga industri farmasi, karena memiliki berbagai keunggulan: waktu analisis yang singkat, kebutuhan sampel kecil, kemampuan menganalisis senyawa organik dan anorganik, serta kolom yang dapat digunakan kembali. Keberadaan HPLC menjadikan proses pemisahan senyawa yang dulunya memakan waktu berhari-hari kini bisa diselesaikan hanya dalam hitungan menit dengan hasil yang jauh lebih presisi.

        Secara terminologi, High Performance Liquid Chromatography (HPLC) adalah metode pemisahan analitis yang memanfaatkan fase gerak cair bertekanan tinggi untuk membawa sampel melewati fase diam dalam kolom, sehingga komponen campuran dapat dipisahkan berdasarkan perbedaan afinitas atau interaksi kimia antara molekul dengan kedua fase tersebut

        Prinsip dasar HPLC berlandaskan pada mekanisme partisi dan adsorpsi, di mana setiap molekul dalam campuran akan berdistribusi berbeda antara fase diam dan fase gerak. Senyawa yang lebih kuat berinteraksi dengan fase diam akan tertahan lebih lama, sedangkan senyawa yang lebih mudah larut dalam fase gerak akan lebih cepat terdorong keluar kolom (Harris, 2015).

 

        Proses pemisahan ini divisualisasikan dalam bentuk kromatogram, grafik yang menampilkan puncak-puncak (peaks) dengan waktu retensi yang spesifik untuk masing-masing senyawa. Analisis kuantitatif dilakukan dengan mengukur luas atau tinggi puncak, yang sebanding dengan konsentrasi senyawa dalam sampel (Angraini & Desmaniar, 2020).

        Penggunaan tekanan tinggi (hingga >400 bar) memungkinkan fase gerak melewati partikel fase diam berukuran mikron (3–5 µm), sehingga menghasilkan efisiensi pemisahan tinggi, waktu analisis singkat, dan resolusi tajam. Kemampuan ini menjadikan HPLC metode yang unggul untuk analisis senyawa organik maupun anorganik yang tidak dapat diuapkan atau tidak stabil pada suhu tinggi. (Rosydiati, 2019).

        Sistem HPLC terdiri dari beberapa komponen utama yang bekerja secara terpadu untuk mencapai pemisahan senyawa yang efisien dan akurat. Setiap bagian memiliki fungsi spesifik dan saling mendukung dalam proses analisis

 

1.     Reservoir dan Pompa

Reservoir berfungsi sebagai wadah fase gerak yang akan digunakan dalam proses pemisahan. Dari reservoir, pelarut dipompa menggunakan pompa bertekanan tinggi yang mampu menghasilkan tekanan hingga ratusan bar. Tekanan ini diperlukan agar fase gerak dapat melewati partikel fase diam yang berukuran mikron di dalam kolom. Stabilitas laju alir pompa sangat penting karena mempengaruhi waktu retensi dan reproducibility analisis.

2.     Injektor

Injektor digunakan untuk memasukkan sampel ke dalam aliran fase gerak dengan volume yang sangat presisi (biasanya dalam µL). Sistem injektor modern menggunakan autosampler yang dapat menginjeksikan banyak sampel secara otomatis dengan akurasi tinggi, meminimalkan kesalahan manusia.

3.     Kolom

Kolom adalah jantung dari sistem HPLC, tempat terjadinya pemisahan senyawa. Kolom biasanya terbuat dari baja tahan karat dan berisi partikel padatan berukuran 3–5 µm sebagai fase diam. Jenis kolom dapat bervariasi, seperti silika termodifikasi C18 untuk metode reverse-phase yang paling umum digunakan. Parameter seperti panjang kolom, ukuran partikel, dan jenis fase diam menentukan efisiensi dan resolusi pemisahan.

4.      Detektor

Detektor mendeteksi senyawa yang keluar dari kolom dan mengubahnya menjadi sinyal listrik. Jenis detektor yang sering digunakan antara lain:

-       UV-Vis Detector: mendeteksi senyawa yang menyerap sinar ultraviolet atau tampak.

-       Fluorescence Detector: digunakan untuk senyawa yang dapat berfluoresensi.

-       Refractive Index Detector: mendeteksi perubahan indeks bias fase gerak akibat adanya senyawa.

Pemilihan detektor disesuaikan dengan karakteristik senyawa target dan sensitivitas yang dibutuhkan (Harris, 2015).

5.     Sistem Data

        Sistem data berfungsi merekam sinyal dari detektor dan menghasilkan kromatogram dalam bentuk grafik. Dari kromatogram ini, peneliti dapat menentukan jenis senyawa (berdasarkan waktu retensi) dan konsentrasinya (berdasarkan luas atau tinggi puncak). Kombinasi seluruh komponen ini memungkinkan

HPLC bekerja secara efisien dalam memisahkan campuran senyawa dengan presisi tinggi. Seiring perkembangannya, HPLC memiliki beberapa metode pemisahan yang disesuaikan dengan karakteristik senyawa dan tujuan analisis. Pemilihan mode ini penting karena mempengaruhi mekanisme interaksi antara fase gerak, fase diam, dan analit..

1.     Normal Phase HPLC (NP-HPLC)

Pada mode ini, fase diam bersifat polar (misalnya silika tanpa modifikasi), sedangkan fase gerak bersifat non-polar (seperti heksana). Senyawa yang lebih polar akan berinteraksi kuat dengan fase diam dan memiliki waktu retensi lebih lama. NP-HPLC umum digunakan untuk memisahkan senyawa-senyawa polar dan isomer geometris

2.     Reverse Phase HPLC (RP-HPLC)

Ini adalah mode paling sering digunakan. Fase diamnya bersifat non-polar (misalnya silika termodifikasi rantai C18), sedangkan fase gerak bersifat polar (campuran air dan pelarut organik seperti metanol atau asetonitril). Senyawa non-polar cenderung tertahan lebih lama di kolom. RP-HPLC banyak diaplikasikan dalam analisis obat, metabolit, dan senyawa biologis karena kompatibilitasnya yang luas

3.      Ion Exchange HPLC (IEX-HPLC)

Teknik ini memisahkan molekul berdasarkan muatan listriknya. Fase diam mengandung gugus bermuatan positif atau negatif yang akan berinteraksi dengan ion dari analit. Mode ini ideal untuk analisis asam amino, protein bermuatan, dan anion atau kation anorganik

4.     Size Exclusion HPLC (SE-HPLC)

Disebut juga gel filtration chromatography, metode ini memisahkan molekul berdasarkan ukuran dan berat molekul. Partikel fase diam memiliki pori-pori tertentu yang memungkinkan molekul kecil masuk dan bergerak lebih lambat, sementara molekul besar terelusi lebih cepat. SE-HPLC digunakan untuk pemisahan protein, polisakarida, dan makromolekul lainnya (Harris, 2015).

5.     Affinity HPLC

Mode ini menggunakan fase diam yang mengandung ligan spesifik yang dapat berikatan dengan molekul target secara selektif. Teknik ini banyak digunakan dalam bioteknologi, terutama untuk pemurnian enzim, antibodi, atau molekul biologis spesifik lainnya

         Setelah memahami prinsip kerja dan komponen penting dalam sistem HPLC, langkah selanjutnya adalah melihat sejauh mana teknik ini memiliki keunggulan dibandingkan metode pemisahan lainnya. Meski HPLC telah menjadi standar emas dalam analisis kimia modern, setiap teknologi tentu memiliki kekuatan dan keterbatasan. Memahami hal ini penting agar pengguna dapat menentukan kapan HPLC menjadi pilihan paling efektif, dan kapan metode alternatif lebih sesuai digunakan.

Secara umum, kelebihan utama HPLC adalah:

1.     Sensitivitas dan Resolusi Tinggi

HPLC mampu mendeteksi senyawa dalam jumlah sangat kecil (hingga skala nanogram) dan memberikan pemisahan yang tajam berkat penggunaan kolom berpartikel kecil dengan efisiensi tinggi

2.     Kecepatan Analisis

Tekanan tinggi dan fase diam berukuran mikron memungkinkan waktu pemisahan yang jauh lebih singkat dibandingkan kromatografi cair konvensional, sehingga cocok untuk analisis rutin di laboratorium industri maupun penelitian.

3.     Fleksibilitas Analisis

HPLC dapat digunakan untuk berbagai jenis senyawa, baik organik maupun anorganik, termasuk senyawa non-volatil yang tidak dapat dianalisis dengan teknik kromatografi gas

4.     Presisi dan Reprodusibilitas

Dengan pengendalian pompa dan injektor yang presisi, HPLC menghasilkan data yang konsisten, memudahkan penentuan konsentrasi senyawa dalam sampel kompleks

5.     Kolom yang Dapat Digunakan Kembali

Kolom HPLC memiliki daya tahan yang baik dan dapat digunakan berulang kali selama kondisi pemakaian dijaga dengan benar.

 

    Sementara itu, keterbatasan HPLC yang perlu diperhatikan antara lain:

1.     Biaya Operasional Tinggi

Harga instrumen HPLC relatif mahal dan penggunaan pelarut dalam jumlah besar meningkatkan biaya analisis

2.     Kebutuhan Pemeliharaan dan Kalibrasi

Untuk menjaga kinerja optimal, sistem HPLC memerlukan perawatan rutin seperti pembersihan kolom, kalibrasi pompa, dan detektor

3.     Tidak Cocok untuk Senyawa Volatil

Senyawa yang mudah menguap lebih sesuai dianalisis menggunakan Gas Chromatography (GC), sedangkan HPLC lebih efektif untuk senyawa non-volatil atau termolabil

4.     Potensi Degradasi Sampel

Beberapa senyawa dapat mengalami degradasi selama analisis akibat reaksi dengan fase gerak atau kondisi tekanan tinggi

 

        Dengan mempertimbangkan kelebihan dan keterbatasan ini, HPLC tetap menjadi metode yang paling handal untuk pemisahan dan analisis senyawa kompleks, serta berperan penting dalam memastikan keamanan obat, pangan, dan lingkungan di berbagai sektor industri modern.

DAFTAR PUSTAKA

 

Angraini. N., & Desmaniar, P. (2020). Optimasi penggunaan High Performance Liquid Chromatography (HPLC) untuk analisis asam askorbat guna menunjang kegiatan Praktikum Bioteknologi                                Kelautan,           Jurnal           Penelitian                                Sains,    22(2),    69. https://doi.org/10.56064/jps.v2212.583

 

Harris, D. C. (2015). Quantitative Chemical Analysis (9th ed.). New York: W. H. Freeman and Company. Info Advisains. (n.d.). Panduan Lengkap HPLC: Prinsip Kerja dan Aplikasinya. Diakses 1 Agustus 2025, dari https://share.google/V3ysQ4BqGvco5SdWR

 

Rosydiati. (2019). Karakterisasi puncak kromatogram dalam High Performance Liquid Chromatography (HPLC) terhadap perbedaan fase gerak, laju alir, dan penambahan asam dalam analisis Indole Acetic Acid (IAA). Jurnal Kandaga. 1(2), 65-73.